서론
식육가공품에 속하는 분쇄 및 혼합 육가공품은 원료육에 식품첨가물을 가하거나 그 원형을 알아볼 수 없도록 분쇄, 절단 등의 방법을 통해 가공한 제품을 뜻하며, 대표적인 분쇄육가공품은 프레스햄, 햄버거 패티, 미트볼 등이 있다. 현재 육가공품 시장의 규모는 1인 가구의 증가, 간편식의 대중화, 캠핑족의 증가 등으로 점차 증가하는 추세며(MFDS and NFSIS, 2020), 육가공품에 사용되는 원료육은 매우 다양하나 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 원료육은 돼지, 닭, 소 순으로 2018년 기준 전년대비 각각 20.8%, 8.5%, 1.3%로 사용량이 증가하고 있다(aTFIS, 2021). 이러한 시장 규모의 증가에 따라 식품의약품안전처는 여러 원료육을 첨가하여 생산하는 육가공품 특성을 고려하여 제품의 성분표기를 반드시 기재하는 법을 통해 위생적이고 소비자들에게 정확한 정보전달을 하도록 실시하였다(MFDS, 2021).
제품 생산자가 의도적으로 값싼 원료를 사용하거나 불법 첨가물을 사용하는 등 소비자를 속이는 제품을 Economically Motivated Adulteration (EMA) 식품이라고 부르는데(Park et al., 2012), 이는 성분규격 및 표시기준 위반 사례에 해당하며 소비자들의 건강과 알 권리, 공정한 유통질서, 종교, 위생 등에 문제가 야기될 수 있다. 소고기에 값싼 가금류를 혼입(Ayaz et al., 2006)하는 등의 EMA 식품에 대해 미국의 의식품의약품청(Food and Drug Administration)과 영국의 식품기준청(Food Standard Agency), 유럽의 유럽연합등록기관(European Union Regulation)등 여러 국가에서 육가공품의 성분표기를 엄격하게 관리하고 있으며, 한국은 식품의약품안전평가원에서 PCR을 이용한 유전자 판별법을 개발하여 관리를 하고있다. 하지만 이 방법은 하나의 primer를 이용한 Single PCR 방법으로 동시에 여러 종을 식별하기는 어려운 실정이다(NIFDSE, 2013; Kim, 2016).
DNA 분석법 중 종 특이성 primer를 이용한 single PCR로 원료육 분석연구가 진행되었지만(Lahiff et al., 2001; Kesmen et al., 2007; Park et al., 2012; Barakat et al., 2014), 혼합된 원료육 가짓수에 따라 여러 번 분석해야 하는 단점이 있다. 그에 비해 두 가지 이상의 primer를 사용하여 다수의 target DNA를 동시에 증폭할 수 있는 multiplex PCR 기법(Markoulatos et al., 2002)은 PCR 조건 최적화와 primer 설계 등 실험 설계 단계에서 복잡성이 있지만, 혼합된 시료에서 여러 종을 신속하고 간편하게 검출해 낼 수 있는 장점이 있다(Markoulatos et al., 2002, Dalmasso et al., 2004; Fumain et al., 2013; Nejad et al., 2014; Yoon, 2014). 따라서, 본 연구는 일차적으로 육가공품에 주로 이용되는 소, 돼지, 닭 3종의 식육에 대한 종 식별을 위해 종 특이성 primer를 설계하여 식육원료에 적용한 후, 최종적으로 multiplex PCR을 이용하여 동시에 소, 돼지, 닭 3종의 식육에 대한 종을 식별할 수 있는 시스템을 구축하고 육가공품에 대한 적용 가능성 확인을 위해 실시하였다.
재료 및 방법
1. 공시동물 및 DNA 추출
종 식별을 위해 사용된 식육원료는 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa), 닭(Gallus gallus)이며, 소고기 12개, 돼지고기 5개, 닭고기 7개로 총 24개를 사용하였고, 육가공품은 12개 브랜드의 햄류(8개), 소시지류(23개), 떡갈비류(7개), 패티류(7개), 캔 햄류(7개)로 52개의 genomic DNA를 추출하였다. 또한, 열처리 한 원료육의 종 특이성 평가를 위해 가열육은 소, 돼지, 닭의 원료육 5 g을 식육가공품의 가공조건을 고려하여 70℃에서 30분간 열처리한 후, genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 35 ng/㎕으로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
2. Primer 설계
종 특이성 primer는 Clustal W version 2.1 program (Larkin et al., 2007)을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank database에서 제공된 각 mtDNA의 D-loop, Cytochrome b (Cytb) 염기서열을 alignment 한 뒤 Primer3 program (Untergasser et al., 2012)을 이용하였다. PCR annealing temperature 차이를 최소화하면서 각각 다른 크기로 증폭되도록 하였고, 소, 돼지는 Cytb, 닭은 D-loop에서 설계하였다(Table 1).
3. 종 특이성 PCR
종 특이성 PCR은 각 시료에서 추출된 DNA를 이용하여 축종 별 제작된 primer의 특이성을 평가하기 위해 수행되었다. Template DNA은 3 ㎕이며, PCR 반응액 조성은 10x reaction Buffer, 12 mM dNTP mixture, 0.5 unit prime Taq DNA polymerase (Genet bio, Korea), 10 pmol primer를 포함해 총 25 ㎕로 수행되었다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 denaturation, 94℃에서 1분간 denaturation, 66℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 추가로 extension을 수행하였다.
4. Multiplex PCR
각 축종을 동시에 검출 가능한 multiplex PCR 방법을 개발하기 위해 3가지 소, 돼지, 닭 원료육의 DNA를 동량 비율로 섞어 template DNA로 사용하였고, 종 특이성 primer set를 이용하여 분석하였다. PCR 반응액은 앞선 종 특이성 PCR 방법에서 primer Taq DNA polymerase (Genet bio, Korea)를 1 unit으로 변경하여 사용하였고, PCR 반응조건은 동일하게 수행하였다. 이후, 구축된 primer set를 육가공품의 적용 가능성을 확인하기 위해 육가공품에서 추출한 DNA를 활용하여 multiplex PCR을 실시하였다.
5. 검출한계 실험
원료육과 가열육의 검출한계를 알아보기 위해 추출된 DNA를 희석하여 각 축종별 검출한계를 시험하였다. PCR을 위한 반응액 조성과 조건은 종 특이성 PCR과 같다.
결과 및 고찰
1. 종 특이성 PCR
3개 축종별 primer의 특이성을 확인하기 위하여 원료육과 가열육에서 추출한 DNA와 primer set를 사용하여 종 특이성 PCR를 실시하였고, 증폭된 산물을 전기영동하여 Fig. 1에 나타냈다. 축종별 원료육과 가열육의 PCR 결과를 살펴보면, 소는 384 bp, 돼지는 249 bp, 닭은 721 bp에 증폭된 것을 확인할 수 있었으며, 각 primer에 대한 교차반응 여부를 확인하기 위해 혼합된 DNA와 primer set를 PCR한 결과에서 다른 종과 교차반응이 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
2. 원료육과 가열육의 검출한계
Primer set를 이용하여 원료육과 가열육에서 추출한 DNA를 혼합하였고, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng/㎕로 희석하여 종 특이성 PCR 반응조건으로 검출한계를 시험한 결과를 Fig. 2에 나타냈다. 원료육에서는 소, 돼지, 닭이 최대 0.01 ng/㎕까지 검출되는 것을 확인하였으며, 가열육에서는 소는 최대 0.01 ng/㎕, 돼지와 닭은 최대 0.1 ng/㎕까지 검출되는 것을 확인하였다. Koh 등(2011)은 소, 돼지, 닭, 오리의 DNA를 혼합하여 PCR을 수행하였는데, 소와 닭은 100 fg/㎕, 돼지와 오리는 1 pg/㎕까지 확인하여 소와 닭의 검출가능성이 높다고 보고하였다. 가열육의 경우 DNA 추출 시 가장 큰 영향을 받는 효과는 열처리로 DNA 붕괴의 가능성이 높다고 보고되었다(Martin et al., 2007a; 2007b). 급격한 열처리는 DNA 구조를 불안정한 상태로 만들어 DNA를 보유하고 있는 세포가 파괴 및 변형이 이루어지는데, 이 시점부터 물리적, 화학적 처리를 통한 DNA 추출의 성공률이 급격하게 떨어지게된다. 특히, 상대적으로 큰 bp를 가진 닭의 경우는 본 연구에 사용한 primer 보다 작은 크기의 종 식별 염기서열을 발견하거나 핵에서만 DNA을 추출하는 것이 아닌 mtDNA 추출, 미량의 생물학적 검체을 통한 DNA를 추출 등 여러가지의 DNA 확보 방안을 모색하는 것이 판단된다(Holland et al., 1993; Amorim et al., 2019).
3. Multiplex PCR을 이용한 육가공품 분석 결과
육가공품에서 추출한 DNA를 사용하여 multiplex PCR을 실시하였고, 증폭된 산물을 전기영동하여 Fig. 3에 나타냈다. 이후, 육가공품에 표기된 성분과 전기영동을 통한 종 식별 결과를 Table 2에 나타냈다. 햄류, 패티류, 소시지류의 표기성분과 multiplex PCR의 결과를 살펴보면, 모든 제품에서 표기된 성분과 동일하게 종 식별이 확인되었다. 반면, 떡갈비의 1번, 4번과 캔 햄의 7번에서 표기된 성분과 종 식별된 결과가 다르다는 것을 확인하였다. 떡갈비 1번, 4번에서 닭의 종 식별이 보였고, 캔 햄 7번은 표기성분에 닭이 표기되어있으나 종 식별이 되지 않는 것을 확인하였다. Heo 등(2014)의 연구에 따르면, 쇠고기 육포에 대한 실험실 및 현장조사 실시 결과로 식육별 공정라인이 분리되어 있지 않아 돈육이 비의도적으로 혼입될 가능성을 확인하였다. 본 연구에서도 육가공품 역시 가공라인이 분리되지 않을 가능성이 있으며, 국내 제조업체에서는 기계류의 세척관리, 가공공정 개선이 필요한 것으로 사료된다. 캔 햄의 7개 제품에서 밴드가 전체적으로 흐리게 나타났는데, 이는 캔의 DNA가 잘 추출되지 않았거나 캔 가공제품의 특성상 보존을 오래하기 위해 살균을 목적으로 한 방사선 조사의 종류인 γ선 이온화 에너지를 식품에 쐬면 식품의 주형 DNA 구조가 파괴되고 이와 동시에 포름알데히드, 벤젠 등 PCR 증폭에 있어 저해물질들이 생성된 것으로 판단된다(Yoon, 2014).
결론
본 연구는 육가공품에서 종 식별 마커의 multiplex PCR 방법에 대한 적용 가능성을 확인하고 실시하였다. 육가공품에서 가장 많이 사용되는 소, 돼지, 닭의 종 식별 마커를 선별하여 원료육과 가열육에서 추출한 DNA를 활용하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, 원료육과 가열육에서 소, 돼지, 닭의 종 식별 마커가 교차반응 없이 모두 식별이 가능하였고, 검출한계 실험은 원료육에서 소, 돼지, 닭이 최대 0.01 ng/㎕, 가열육에서는 소는 최대 0.01 ng/㎕, 돼지와 닭은 최대 0.1 ng/㎕으로 가열로 인한 DNA 파괴를 고려하더라도 육가공품에서 충분히 종 식별이 가능할 것으로 판단된다. 이후, 5종류로 나눈 52개의 육가공품에 multiplex PCR를 실시하였다. 표기된 성분과 종 식별 PCR 결과, 햄류, 패티류, 소시지류에서 표기된 성분과 multiplex PCR의 종 식별 결과가 동일하였으나, 떡갈비 1번, 4번의 제품이 표기된 성분 외에 닭의 특이적 반응이 검출됨으로써 의도적 또는 비의도적으로 닭고기가 포함되었으며, 캔 햄 7번의 제품에서 표기된 돼지, 닭 중 돼지만 특이적 반응이 검출되어 제품의 원재료명과 표기가 다른 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 육가공품 제조 시 실제로 표기되지 않은 축종, 특히 가장 값이 저렴한 닭고기를 사용할 가능성이 있음을 확인하였으며, 허위기재의 가능성 또한 확인하였다. 육가공품 원료육 표기의 정확도 향상 및 육가공품에 대한 소비촉진을 위해 육가공품에 대한 원료육의 종 식별뿐만 아니라 원료육 성분비 판별을 위한 추가연구가 필요할 것으로 판단된다.
